微波炉在临床快速病理技术中的应用

湘潭市第一人民医院病理科

 随着医院深化改革和等级评定,病理科在医院的位置越来越显著,临床各科都要求既快又准地获得病理报告,但广大中小医院病理科设备简陋,大都没有较好的脱水机、恒冷冰冻切片机,靠人工方法要使一个标本从固定到得到一张理想的切片,起码要三天以上时间,因此,如何在缺乏现代化病理设备的前提下充分发挥病理诊断的临床指导作用已是所有病理科面临的共同难题,而微波技术在诊断病理领域初步应用的结果为解决这一难题提供了可喜的苗头,预计在今后几年将成为病理科的常规手段,因此,有必要对此作一概述和分析。

    1 微波应用于病理组织的历史回顾

早在1970年, Mayers[1]就首次应用微波做为一种组织固定的方法。但被病理学者接受此技术的过程则是比较缓慢的。在1983年, Brinn[2]应用微波于光镜特染领域,结果表明所有特染的时间都大大缩短,而且背景也得到了根本改善。到1987年,Kok[3]把微波应用于冰冻切片,使得切片质量得到了很大提高,而且没有什么人工假象。在同一年, Coates[4]把微波用于原位杂交过程,使其在保持与标准杂交方法相同敏感性的前提下,具有更干净的背景。而且整个过程的用时大大缩短。在1989年,Leong[5][6]在免疫组化中应用微波,不仅缩短了染色时间,而且微波在组织抗原保留上具有其它方法无可比拟的优点。到了1990年, Gove[7]成功地应用微波使电镜样品的制备在2小时内完成。在1991年, Shi[8]首次描述了微波在组织抗原修复过程中的独到作用。

    2 微波作用于组织的原理

微波是一种非离子射线,通常由频率为2.5GHz的家用微波炉产生。当极性分子,象水及具有极性的蛋白质链暴露在快速交替的电磁场中时,这些分子将以每秒25亿次的频率做往返180°的振动,在一定能量下,分子振动就导致了瞬间热的产生。微波在组织固定,染色及其它过程中的应用,热被认为是作用的首要因素。其次在电磁场中快速振动的分子也起着不可低估的作用。热能够增加分子的动力,从而促进化学反应。由微波产生的快速分子振动将直接导致分子碰撞的增加,从而直接加速了反应进程。微波加速组织在固定液中的固定过程与微波能降解固定液中一般存在的不易透入组织的多聚体转化成易于透入组织的单体或二聚体有关,当然,这时的温度也起着重要的作用。另外,还有许多物理机械作用也可能在微波照射中起一定作用。例如:由微波产生的质子能量,虽然对让它去影响共价键来说能量还太小,但不除外这些能量去影响疏水键的结构以及细胞膜上精确立体构象的能力[9]。

    3 目前主要应用的范围

3.1 组织固定

首先所有活检标本都是放在10%的甲醛中后送到病理科,这一点是必要的,以避免组织自溶及其它在运送新鲜标本时可能出现的错误。到病理科后标本应立即检查,并切成2mm厚的标本块后放入塑料盒中,然后把这些标本盒完全浸在等渗盐水(生理盐水)中,用微波加热到62℃。这在2.4GHz输出功率600瓦的家用微波炉中约需120秒。尽管在更高温度时对形态结构的保存更好,但不能超过72℃。我们采用的是60℃68℃这一范围的温度。因为我们发现这个温度范围是保存组织抗原的最佳温度[10]。

    3.2 组织脱水、透明及浸透

把微波应用于组织脱水、透明及浸蜡过程中,可极大地加快标本处理过程。一般微波固定组织块不超过5分钟,然后把组织块分别放入70%酒精、二甲苯及熔化的石蜡中,各用微波照射5分钟后,就可进行石蜡包埋。全部组织脱水,透明及浸透过程只需15分钟。由此所制切片的质量是有保证的。

    3.3 特染

在组织特染过程中应用微波照射,将大大缩短反应时间,从而加快了组织特染过程。不论是石蜡切片还是树脂包埋切片的特染,都能在微波作用下加速。如乌洛托品银染,常规一般需要90-180分钟,当在酸氧化阶段用微波照射几十秒钟,就会使此染色在20分钟内完成[2]。同理,微波还可用于Masson、Perls、AB、PAS、Steiner、Grocott's、Warthin-starry染色及网织纤维染色和对黑色素的胶体硝酸银染色等。

微波除了大大减少染色时间外,还可大大减少切片的非特异性沉淀,从而使得染色背景非常干净。另外微波还可使切片脱蜡一次完成,特别是在对病原体染色时,用640瓦的微波照射30-60秒还起到杀死病原体的作用,从而减少对人的传染。

    3.4 冰冻切片

微波在冰冻切片中的应用,极大地改善了组织细胞的形态。

把新鲜的冰冻切片浸入Kryofix或Wolman氏液中(95%乙醇, 5%冰醋酸)。在"高档"微波作用下15秒,将使切片质量得到极大的提高。特别是没有任何人工假象,同时也不延长冰冻切片的时间。实事证明,上述过程是成功的,它所得到的切片与常规在95%乙醇、10%甲醛或在甲醛蒸汽中固定的切片相比,其组织细胞形态得到了根本改善[3]。

    3.5 免疫组化

现在,免疫组化已是病理诊断的重要辅助手段之一。在石蜡切片上良好地保留组织抗原就显得尤为重要。尽管在甲醛固定及常规制片中也保留了部分抗原,但许多象淋巴细胞膜抗原和其它不稳定抗原在常规甲醛固定制片过程中丢失[11]。甲醛固定对中间丝免疫染色也有消减作用,特别是NF、Vimentin、desmin和cytokeratin。所有这些染色在肿瘤分析时都特别重要。在用甲醛固定的实验组,一天后其中间丝蛋白的NF、Vimentin、和Desmin就无法用单克隆抗体标记。白细胞共同抗原(CD45)及用CDw75、CD74和CD45RO标记的淋巴细胞抗原在三天后已普遍丢失。在十四天后就只有很少的象S-100、PSA、CEA和甲状腺球蛋白等具有少许的抗原残留。在用微波处理的对照组,大部分抗原得到保留。当与实验组免疫染色比较时,微波处理的组织染色强度更强、更广泛和更具说服力[12]。

另外在免疫组化实际操作中,微波处理的组织除Keratin和Desmin,其它都可省去蛋白水解酶消化这一步,同时也可用于染CD22和CD5等淋巴细胞抗原,这些抗原在甲醛固定时大都丢失[13]。

当然微波也可直接用于免疫组化染色过程。它将大大加速抗原抗体反应过程,从而使得需要二～三步的标准过氧化酶染色过程在20分钟以内完成[14]。

近来,微波在组织抗原恢复上得到了广泛应用。因为许多抗原在甲醛固定后其组织抗原被封闭,但把这些组织切片放入10mM的构橼酸盐平衡液中,用微波加热至沸腾后,其组织的大部分抗原在免疫染色中得到极大改善[15]。3.6 电镜

微波在电镜制样方面的应用具有良好的前景。首先微波可以加速样品在Karnovsky氏固定液(0.05%戊二醛和2%甲醛)中的固定过程[16]。具体方法如下: 把组织样品放入一个有2ml戊二醛固定液的小玻璃瓶中,在瓶下放一个1.5 cm厚的聚苯乙烯垫后放入微波炉,用微波加热到50℃,这通常只需5-10秒,就可完成整个固定过程。同理,微波也可用于扫描电镜样品的固定。

    3.7 原位杂交

近来,微波已扩展应用于分子技术领域。可用于加速占用很长时间的组织固定过程而不损伤细胞核的DNA 。微波还可直接用于所有原位杂交过程中,其结果大大加速了用免疫金银、硷性磷酸酶及链卵蛋白标记法检测DNA的原位杂交过程[4]。与标准杂交方法相比,其敏感性相同,但减少了背景着色,而且使整个孵育时间成功地减少到1-2小时[16]。

    4 展望